Разработка технологии синтеза УДФ-глюкозы с использованием ферментов метанотрофных бактерий
Аннотация
Целью данной работы является создание методики использования ферментов метанотрофных бактерий для синтеза УДФ-глюкозы, а также характеристика УДФ-глюкопирофосфорилазы. Оптимальная температура работы изученного фермента – 55 ºС,оптимум рН – 7 в буфере Tris-HCl, оптимальная концентрация MgCl2 – 6 мМ. Наблюдается повышение активности термостабильного фермента при 50 ºС, сохранение свыше 80%активности при 60 ºС. Были описаны кинетические параметры фермента: он подчиняется закону Михаэлиса-Ментен. Фермент имеет высокие активность (максимальная скорость –45±2 E/мг) и сродство к субстратам (Км(УТФ) = 0,71±0,09мМ и Км (глюкозо-1-фосфат) =0,21±0,03мМ ). Полученная УДФ-глюкопирофосфорилаза пригодна для ферментативногосинтеза; выход продукта составляет 80%.
Также был опробован киназный метод синтеза УДФ-глюкозы с использованием полифосфат зависимого фермента Methylomonas methanica и синтазный с использованием сахарофосфорилазы Leuconostoc mesenteroides. Первый метод оказался неэффективен ввиду зависимости реакции от фосфоглюкомутазы катализирующей одну из промежуточных стадий синтеза, от присутствия эффектора – глюкозо-1,6-бисфосфата. Второй метод показал выход продукта в 75%.
Также был опробован киназный метод синтеза УДФ-глюкозы с использованием полифосфат зависимого фермента Methylomonas methanica и синтазный с использованием сахарофосфорилазы Leuconostoc mesenteroides. Первый метод оказался неэффективен ввиду зависимости реакции от фосфоглюкомутазы катализирующей одну из промежуточных стадий синтеза, от присутствия эффектора – глюкозо-1,6-бисфосфата. Второй метод показал выход продукта в 75%.